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引物设计软件primer一文搞懂引物设计
发布时间：2022-12-14 15:39:13 文章来源：综合网络
引物设计原则作为一个科研狗，日常实验中经常会遇到引物设计，毫无疑问，一对好的引物对实验结果很重要。在设计引物前，我们首先了解一下引...

引物设计原则

作为一个科研狗，日常实验中经常会遇到引物设计，毫无疑问，一对好的引物对实验结果很重要。在设计引物前，我们首先了解一下引物设计的原则，总结为以下7点：

1. 要设计引物首先要找到DNA 序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。

2. 引物长度一般在15～30碱基之间，因为过长会导致其延伸温度大于 74℃，不适于 TaqDNA 聚合酶进行反应。同时，G+C 含量在40%～60%之间，过高或过低都不利于引发反应，而且两条引物之间GC含量不能相差过大。

3. 为了避免引物形成二级结构以及引物之间形成二聚体，引物自身不能有连续4个碱基的互补。引物之间不能有连续4个碱基的互补。

4. 引物 3’端的末位碱基对 Taq 酶的 DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。

5. 引物的延伸是从3′端开始的，不能进行任何修饰。3′端也不能有形成任何二级结构的可能以免影响扩增。不过引物的5′端可以修饰。

6. 引物所对应模板位置序列的Tm值在55℃～80℃之间。Tm 值的计算有多种方法，如按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)。

引物设计方法

下面开始介绍设计引物的方法, 总结为以下五种：

1)NCBI在线设计;

2)引物合成公司在线设计;如：

Origene公司，http://www.origene.com.cn/qPCR/primers.aspx;

生工，https://www.sangon.com/newPrimerDesign;

3)Primer 引物设计软件;

4)引物数据库(如Primerbankhttps://pga.mgh.harvard.edu/primerbank/);

5)查询相关文献(建议参考高分的文献)。

1) NCBI在线设计

1. 打开NCBI官网(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，将搜索数据库改为“Gene”，以白介素6为例：

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2. 在新打开的页面中找到 “NCBI Reference Sequences (RefSeq)”，进入序列页面：

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IL-6的cDNA序列，红色部分为编码区域。

3. 再点击页面右侧的“Pick Primers”：

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4. 再点击”get primers”：

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即可获得引物，网站一般给出十条：

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2)引物合成公司在线设计

① 通过上海生工网站进行设计

首先需要去NCBI上找到基因的参考序列，将序列输入网站，并选择引物用于具体哪个实验以及物种等，最后点击提交即可得到引物序列。

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② 通过Origene公司设计

输入需要设计引物的基因名并选择物种，点击“GO”，网站就会显示出一条序列，值得注意的是，这条序列都是经过验证的通用序列。由于该公司合成引物价格太贵，因此不推荐大家选择这个公司去合成，但是可以使用它们的序列。

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3)通过Primer Premier引物设计软件进行设计

首先将要设计的基因的参考序列复制进去，再点击设计引物，软件会自动设计出一条引物，再单击“AllPrimers”，软件就会显示出所有的引物序列，包括引物序列的各项特征。

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4)通过引物数据库，例如primer bank

需要注意的是，这个网址输入的是基因的NCBI编号或者GI号，这些在NCBI上面都可以查到，不能直接输入基因名。输入后点击“Submit”即可获得引物。

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5)通过查询相关文献，建议通过谷歌学术

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总结

在具体设计引物的时候，推荐大家优先使用高分文献中使用的序列，因为已经经过验证，一般来说不会有什么问题。其次，可以使用Origene这个公司网站进行设计，这个公司只会给你一条序列，但是给出来的一般都是通用的，所以问题也不大。但是对于一些不常见的基因，可能在谷歌学术里面搜不到相关文献，这时候就推荐使用NCBI或者Primer Premier软件进行设计，值得注意的是，由于使用Primer Premier软件进行设计输入的是基因的参考序列，所以设计出来的引物都是没有经过Blast验证的，进一步的话需要去NCBI进行primer blast以验证引物特异性。

关于引物设计方法就介绍到这里了。最后，祝大家实验顺利!

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